一般而言，考慮到ADC依賴抗體介導(dǎo)的內(nèi)化將細(xì)胞毒性載荷輸送至腫瘤細(xì)胞，開發(fā)ADC（抗體偶聯(lián)藥物）時(shí)需要注意的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是抗體內(nèi)化能力的定量評(píng)估。
但是傳統(tǒng)檢測(cè)方法目前仍然存在許多缺點(diǎn)，最近先聲藥業(yè)旗下先聲再明的研究團(tuán)隊(duì)在mAbs上發(fā)表了一篇文章，為抗體內(nèi)化能力的評(píng)估提供了一個(gè)高靈敏度、高通量、無(wú)需化學(xué)修飾的內(nèi)化評(píng)估平臺(tái)。
本文將對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。
現(xiàn)有抗體內(nèi)化評(píng)估方式的缺點(diǎn)
傳統(tǒng)內(nèi)化檢測(cè)方法大致分為直接法和間接法。直接法將初級(jí)抗體與細(xì)胞毒性載荷、放射性同位素或熒光團(tuán)偶聯(lián)。這種方法雖然直觀，但每個(gè)抗體都需要進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)修飾，步驟繁瑣，耗時(shí)耗力，難以用于大規(guī)模篩選。
另外一種方法則采用的是某種“中介”蛋白大分子，比如說(shuō)次級(jí)抗體和肽基系統(tǒng)，但是這種做法的缺點(diǎn)也很明顯，就是蛋白尺寸過(guò)大，可能阻礙抗體內(nèi)化。比如Mab-ZAP法其中用到的蛋白分子量約210 kDa，其發(fā)揮細(xì)胞毒性依賴于內(nèi)化過(guò)程。然而，當(dāng)它與抗體結(jié)合時(shí)，分子量增大到≥360 kDa，這種較大的尺寸可能會(huì)阻礙抗體的內(nèi)化。此外，它對(duì)小鼠抗體具有特異性，這一特性限制了它在更廣泛場(chǎng)景中的應(yīng)用。
又比如，傳統(tǒng)的DT3C方法，其中介分子是一個(gè)重達(dá)約70 kDa的融合蛋白。當(dāng)它與抗體結(jié)合后，形成的復(fù)合物體積龐大，很容易在空間上阻礙抗體與癌細(xì)胞的精準(zhǔn)對(duì)接。
此外，這些大分子中介的適用性也有限，同樣以DT3C為例，該融合蛋白包含了白喉毒素（DT）與鏈球菌G蛋白的1C、2C和3C結(jié)構(gòu)域，不過(guò)，不同細(xì)胞類型對(duì)DT/皂素的敏感性存在差異，這種變異可能導(dǎo)致DT3C與實(shí)際抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）的性能缺乏相關(guān)性，從而限制了它的應(yīng)用。
因此，這些大分子蛋白可能無(wú)法兼容所有類型的抗體或癌細(xì)胞。
先聲再明研究團(tuán)隊(duì)追求的是，分子量更小，更兼容的抗體內(nèi)化評(píng)估工具。
鏈霉菌G蛋白3C平臺(tái)
上文提到的DT3C中鏈球菌G蛋白3C結(jié)構(gòu)域其實(shí)可以單獨(dú)拿出來(lái)，研究人員對(duì)此進(jìn)行了優(yōu)化，他們對(duì)這個(gè)小巧的3C肽段進(jìn)行了工程化改造，給它接上了一個(gè)含三個(gè)半胱氨酸的短肽，這一短肽的接入能使其像是配鑰匙一樣搭配上不同的毒素和熒光染料工具。
通過(guò)激活硫醇基團(tuán)與毒素分子或pH敏感染料反應(yīng)，研究人員成功生成3C-毒素（分別加裝微管蛋白抑制劑和拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，3C-TopIi、3C-Tubi）和3C-pHAb（熒光染料）。
3C-毒素復(fù)合物能通過(guò)細(xì)胞表面抗原結(jié)合、內(nèi)化并釋放游離毒素誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，而3C-pHAb復(fù)合物則通過(guò)pH敏感熒光信號(hào)定量實(shí)時(shí)追蹤內(nèi)化抗體。
3C肽段本身非常小巧，連接上毒素或染料后，整個(gè)3C偶聯(lián)物的分子量也遠(yuǎn)小于30 kDa。這就是其典型優(yōu)勢(shì)。
3C復(fù)合物的驗(yàn)證
研究人員首先通過(guò)3C-pHAb的熒光強(qiáng)度來(lái)定量監(jiān)測(cè)抗體內(nèi)化。在HER2高表達(dá)的SKBR3細(xì)胞中，trastuzumab（曲妥珠單抗）+3C-pHAb孵育顯示時(shí)間依賴性熒光信號(hào)增加。
此外，3C-pHAb有效量化了針對(duì)CDH6、LIV-1和LYPD3等多樣靶點(diǎn)的內(nèi)化，熒光強(qiáng)度與抗原表達(dá)水平相關(guān)。
研究人員還在GPC3抗體的內(nèi)化效果中進(jìn)行了比較，他們用不同的GPC3靶向抗體評(píng)估了3C-pHAb。內(nèi)化效率排序?yàn)镚PC3-Ab-1 > GPC3-Ab-3 > GPC3-Ab-4，而GPC3-Ab-2的內(nèi)化效果幾乎可以忽略不計(jì)。源自這些抗體的ADC的細(xì)胞毒性反映了內(nèi)化等級(jí):GPC3-Ab-1 ADC表現(xiàn)出最強(qiáng)的細(xì)胞殺傷活性，而GPC3-Ab-2 ADC最不有效。
這些方法的驗(yàn)證說(shuō)明，3C-pHAb確實(shí)是個(gè)可用作大量篩選的工具，對(duì)于可視化的內(nèi)化監(jiān)測(cè)有著很重要的作用。
除了使用3C-pHAb可視化內(nèi)化外，研究人員還開發(fā)了一種能實(shí)現(xiàn)快速互補(bǔ)的3C-毒素復(fù)合物策略，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞毒性來(lái)能間接評(píng)估抗體在ADC環(huán)境中的表現(xiàn)。
研究人員使用曲妥珠單抗作為模型抗體，分別對(duì)幾種3C-毒素復(fù)合物進(jìn)行了共孵育。結(jié)果顯示，3C-毒素復(fù)合物可以通過(guò)簡(jiǎn)單地與抗體共孵育而有效地誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，而不需要直接共價(jià)結(jié)合毒素。這種方法不僅簡(jiǎn)化了早期抗體篩選，而且可靠地預(yù)測(cè)了抗體與ADC中類似毒素結(jié)合時(shí)的細(xì)胞毒性結(jié)果。
分析還表明，這種3C毒素法還比DT3C法更加泛用。研究顯示，在面對(duì)CDH6、LIV-1、LYPD3等靶點(diǎn)時(shí)，DT3C方法要么效果不佳，要么完全失效。而3C-毒素在這些“難啃的骨頭”面前，依然能穩(wěn)定工作，其誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷效果與真實(shí)ADC高度吻合。這表明3C技術(shù)具有更廣泛的靶點(diǎn)適應(yīng)性。
總結(jié)
研究人員認(rèn)為，3C偶聯(lián)物平臺(tái)的主要優(yōu)勢(shì)有三，其一是生理相關(guān)性，檢測(cè)結(jié)果能準(zhǔn)確反映實(shí)際ADC性能；其二是高通量篩選，很適用于中大型篩選；三是廣泛適用性，對(duì)多種靶點(diǎn)和抗體格式有效。
期待未來(lái)該先聲再明的研究團(tuán)隊(duì)依據(jù)該3C偶聯(lián)技術(shù)平臺(tái)繼續(xù)發(fā)展，獲得更多技術(shù)授權(quán)認(rèn)可。
參考來(lái)源：
Chen, C., Zhang, Y., Wu, Y., Luan, S., Jiao, X., Liao, J., … Fu, Y. (2025). 3C conjugates: a highly sensitive platform for antibody internalization assessment in ADC development. mAbs, 17(1). https://doi.org/10.1080/19420862.2025.2577161
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